Uttestingen viser at metoden har stort potensiale for en mer effektiv helseovervåking av oppdrettsfisken, sammenlignet med den tradisjonelle metoden som brukes i dag.

Resultatene fra Lisa-Victoria Bernhardts doktorgradsarbeid viser at viruset (SAV), som gir pankreassykdom (PD), kan påvises tidligere i sjøvannprøver tatt inne i merdene sammenlignet med prøvene tatt av fisk i de månedlige prøveuttakene. Hun har også vist at vannfiltreringsmetoden med det kan gi en mer kostnadseffektiv, tidsbesparende, ressursbesparende og ikke minst dyrevelferdsvennlig tilnærming for overvåking av viruset (SAV) som gir PD hos fisken. Dette gir et handlingsrom for tidligere implementering av sykdomskontrolltiltak. Metodikken har sannsynligvis også potensial for å kunne tas i bruk for å påvise andre smittestoffer i vann.

Virussykdommer tar mange fiskeliv og gir store tap for næringen

Oppdrett av atlantisk laks (Salmo salar L.) er en viktig industri i kystområdene i Norge. Det er imidlertid betydelige tap av fisk under produksjonen i sjøvannsfasen. Virusrelaterte sykdommer er blant de viktigste årsakene til dødelighet. Overvåkingsstrategier er dermed viktige tilnærminger i helsestyringen for atlantisk laks. 

Metode som kan erstatte testing på fisk

En av de alvorligste virussykdommene hos laks, er pankreassykdom (pancreas disease - PD), som forårsakes av infeksjon med salmonid alphavirus (SAV). Overvåkingsprogrammet for SAV/PD er månedlig prøvetaking av minst 20 fisk fra hver lokalitet, fra alle oppdrettslokaliteter for laksefisk, med påfølgende PCR-analyse av hjertevev fra fiskene. Fokuset for denne studien var derfor å utvikle en filtreringsmetode for påvisning av SAV i sjøvann, for å kunne erstatte testing av fisk med å ta prøver av vannet fisken lever i.

PCR står for Polymerase chain reaction og er en metode for å oppformere mange kopier av en bestemt DNA-sekvens som deretter kan påvises. Dette gjør det mulig å påvise forekomsten av viruset selv om det finnes lite av det i en prøve.

- Vannfiltreringsmetoden har stort potensiale til å kunne bli implementert som en alternativ metode for overvåking av viruset (SAV) ved oppdrettsanlegg, sammenlignet med metoden som brukes i dag. Den kan nemlig muliggjøre tidligere påvisning av virusets forekomst. Det gjør det mulig å sette inn tiltak for sykdomskontroll tidligere når viruset er identifisert i anlegget eller på naboanlegg. Slik kan en ytterligere spredning av viruset forhindres, sier Lisa-Victoria Bernhardt.  Studien er gjort ved Veterinærinstituttet for prosjektet SafeGuard, som ble finansiert av Norsk forskningsråd (267411). Hun disputerte 17. september ved NMBU Veterinærfakultetet.

Forsøk gjort i tre trinn

Studien ble gjort i tre trinn, in vitro på laboratoriet, smitteforsøk i kar og feltforsøk på flere oppdrettslokaliteter. 

In vitro

In vitro studien, som ble utført under mer kontrollerte forhold ved laboratoriet, involverte tilsetting av viruset (SAV) til kunstig og naturlig sjøvann. Dette bidro til viktig informasjon for metodeutviklingen uten å involvere noen fisk. I denne studien ble viruset konsentrert ved at vannprøvene gjennom elektrofiltrasjon, en metode som involverer membranfiltrering som enkelt forklart drives av bevegelsen av de elektrisk ladede viruspartiklene i prøvene. De høyeste SAV-konsentrasjonene fra vannprøvene ble funnet når man kombinerte elektronegativt ladet filter med en lyseringsbuffer. Lyseringsbuffer inaktiverer viruset gjennom å oppløse proteinkapselen som viruset ligger pakket inn i. 

Smitteforsøk

Smitteforsøket ble gjennomført som en såkalt kohabitant smittemodell med post-smolt atlantisk laks. Dette betyr at SAV-injisert fisk (”smittespreder”) ble satt sammen med fisk som ikke var injisert (”kohabitant fisk”) i samme kar. Deretter ble det tatt ut prøver av kohabitant fisk og sjøvannet parallelt ved flere tidspunkter i forsøket, for sammenligning. Det ble da funnet et samsvar mellom prøvene; stigende mengde SAV i sjøvannet viste samtidig en stigende mengde SAV i fiskevevsprøvene.

Også i denne studien var elektronegativt ladet filter kombinert med lyseringsbuffer den mest egnede metoden for å påvise SAV fra sjøvann.

Uttak av vannprøve fra det øvre vannlaget i karet under smitteforsøket. Foto: privat

Feltforsøk på flere oppdrettslokaliteter

Under feltforsøket ble vannfiltreringsmetoden testet ut i en pilotstudie ved å ta prøver av sjøvann fra forskjellige vanndybder og uttakspunkter fra en PD-diagnostisert merd. Basert på resultater fra denne pilotstudien, ble vannfiltreringsmetoden videre testet ved å ta prøver av sjøvann fra det øverste lag innenfra alle laksemerdene fra flere norske marine oppdrettslokaliteter. Disse lokalitetene hadde ikke noen registrert tilstedeværelse av SAV ved starten av den mere omfattende feltstudien. Vannprøvetaking foregikk parallelt med prøvetaking av fisk i forbindelse med overvåkingsprogrammet for SAV/PD.

Flere funn

Sjøvannprøver tatt fra inne i merdene og kjørt gjennom vannfiltreringsmetoden, viste at viruset (SAV) kunne påvises tidligere sammenlignet med prøvene tatt av fisk. Et annet funn var at jo lavere SAV-konsentrasjon det var i sjøvannsprøvene, jo lengre i tid tok det før SAV-påvisning gjort hos fisk. Dette bekrefter at vannfiltreringsmetoden har et stort potensial for å bli implementert for overvåking av oppdrettsanlegg for å muliggjøre tidligere påvisning av SAV-infeksjon.

Her holder Lisa-Victoria Bernhardt i vannhenteren som ble brukt til å ta ut vannprøver fra forskjellige vanndybder i felt under pilotstudien som ble utført for å finne ut av den mest egnete tilnærmingen for å overvåke for SAV på oppdrettsanlegg. Foto: Privat.

Illustrasjonen viser den trinnvise tilnærmingen for vannfiltreringsmetoden som ble brukt i den mere omfattende feltstudien; fra uttak til analyse av 1 L sjøvannsprøve. Forkortelse: IPC=Intern process kontrol, som besto av et annet kjent virus som ble brukt til å få overblikk på metodikkens ytelse (Kilde: Lisa-Victoria Bernhardts doktorsgradsarbeide “Development, optimization and field testing of a filtration method for detection of salmonid alphavirus in seawater”).

Engelsk tittel på avhandlingen / English title of thesis: Development, optimization and field testing of a filtration method for detection of salmonid alphavirus in seawater

Norsk tittel på avhandlingen / Norwegian title of thesis: Utvikling, optimering og felttesting av en filtreringsmetode for påvisning av salmonid alphavirus i sjøvann

Hovedveileder / Main supervisor: Simon Chioma Weli

Medveileder(e) / Co-supervisor(s): Atle Lillehaug, Lars Qviller, Mette Myrmel

Referanser:

Weli SC, Bernhardt LV, Qviller L, Myrmel M, Lillehaug A. Development and evaluation of a method for concentration and detection of salmonid alphavirus from seawater. J Virol Methods. 2021 Jan;287:113990. doi: 10.1016/j.jviromet.2020.113990. Epub 2020 Oct 6. PMID: 33035567.

Bernhardt LV, Myrmel M, Lillehaug A, Qviller L, Chioma Weli S. Concentration and detection of salmonid alphavirus in seawater during a post-smolt salmon (Salmo salar) cohabitant challenge. Dis Aquat Organ. 2021a Mar 25;144:61-73. doi: 10.3354/dao03572. PMID: 33764314.

Bernhardt LV, Lillehaug A, Qviller L, Weli SC, Grønneberg E, Nilsen H, Myrmel M. Early detection of salmonid alphavirus in seawater from marine farm sites of Atlantic salmon Salmo salar. Dis Aquat Organ. 2021b Sep 9;146:41-52. doi: 10.3354/dao03618. PMID: 34498609.

Bernhardt LV. Development, optimization and field testing of a filtration method for detection of salmonid alphavirus in seawater. Thesis number 2021:38, ISSN 1894-6402, ISBN 978-82-575-1808-0

Kontakt:

Lisa-Victoria Bernhardt:

Linkedin: https://www.linkedin.com/in/lisa-victoria-bernhardt

Email: lv.bernhardt@gmail.com